ویروس لکوز طیور زیرگروه J (ALV-J)، ویروس رتیکولواندوتلیوز (REV) و ویروس کم‌خونی عفونی مرغ (CIAV) از جمله عوامل بیماری‌زای مهمی هستند که از طریق گله‌های مادر منتقل می‌شوند (BDPs) و همچنان سلامت و بهره‌وری طیور را تهدید می‌کنند. این ویروس‌ها اغلب با سرکوب سیستم ایمنی و عفونت‌های همزمان (کوینفکشن) همراه هستند؛ امری که تلاش‌ها برای ریشه‌کنی آن‌ها را، به‌ویژه در نژادهای بومی مرغ، دشوار می‌سازد. در این مطالعه، یک روش مولتی‌پلکس qPCR (M-qPCR) مبتنی بر پروب TaqMan برای تشخیص همزمان ALV-J، REV و CIAV توسعه یافت. این روش عملکردی عالی شامل خطیت بسیار بالا (0.99 < R2)، تکرارپذیری بالا (ضریب تغییرات درون‌آزمونی و بین‌آزمونی کمتر از ۵ درصد)، اختصاصیت قوی (بدون واکنش متقاطع با سایر عوامل بیماری‌زای رایج و غیرهدف در طیور) و حساسیت بالا (با حد تشخیص ۱۰ کپی در میکرولیتر) از خود نشان داد. علاوه بر این، روش مذکور قادر بود عفونت‌های ترکیبی را حتی در شرایطی که غلظت عوامل هدف نامتوازن بود، به‌طور قابل‌اطمینانی شناسایی کند. انجام آزمایش‌های موازی با کیت‌های تجاری سینگل‌پلکس (تک‌هدفه) qPCR نیز قابلیت اطمینان این روش را تأیید کرد و نرخ توافق ۹۵.۸ درصد برای ALV-J، ۹۸.۳ درصد برای REV و ۱۰۰ درصد برای CIAV به دست آمد. به‌کارگیری این روش بر روی سه نژاد بومی مرغ در منطقه گوئیژو (Guizhou) نشان‌دهنده نرخ مثبت ۳۳.۹ درصد (۴۰ از ۱۱۸) برای ALV-J، ۹.۳ درصد (۱۱ از ۱۱۸) برای REV و ۷.۶ درصد (۹ از ۱۱۸) برای CIAV بود؛ همچنین ۲۰.۴ درصد از کل موارد مثبت، مربوط به عفونت‌های ترکیبی (دوگانه و سه‌گانه) بود. افزون بر این، مشخص شد که نمونه‌های سرم در مقایسه با سواب‌های کلوآک، برای تشخیص ویروس با استفاده از روش M-qPCR توسعه‌یافته، مناسب‌تر هستند. در نهایت، روش M-qPCR توسعه‌یافته ابزاری قابل‌اطمینان و کارآمد برای پایش عفونت‌ها و عفونت‌های همزمان در گله‌های طیور فراهم می‌آورد و از اقدامات پیشگیرانه و کنترلی در برابر عوامل بیماری‌زای منتقل‌شونده از گله‌های مادر (BDPs) پشتیبانی می‌کند.